Общая методика определения токсичности воды на дафниях

Для определения токсичности вод необходимо иметь культуру дафний.

При культивировании дафний берут водопроводную воду, отстоянную не менее 7 суток и насыщенную кислородом (не менее 6,.0 мг/л), с pH =7,0 - 8,2; жесткость общая - 3-4 мг/л.

Лучше всего использовать биологизированную воду из аквариума. Кормом служат зеленые водоросли (хлорелла) и хлебопекарные дрожжи. Дрожжи приготовляют так: берут 1 г. свежих или 0,3 г. воздушно-сухих дрожжей, заливают их 100мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают, дают отстояться в течение 30 минут. Используют только жидкость, которую добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды. Кормят дафний 1 - 2 раза в неделю. Зеленые водоросли Chlorella vulgaris можно приобрести в лаборториях и хранить в холодильнике (срок хранения 14 суток). Дозировка кормления для дафний: из расчета 2 мл/л суспензии водорослей хлореллы с плотностью 25-35млн кл/мл.

Оптимальный режим для выращивания водорослей создается при соблюдении следующих условий: питательная среда Тамийя (таблица 4), круглосуточное освещение лампами дневного света и постоянное продувание атмосферным воздухом.

Таблица №4

Состав питательной среды для культивирования зеленых водорослей.

Соли

Среда Тамийя, г/л дист. воды

Среда Успенского №1

KNO3

5.000

0.025

KH2PO4

1.250

0.025

MgSO4*7H2O

2.500

0.025

FeSO4*7H2O

0.003

-----

ЭДТА (Трилон Б)

0,037

-----

CaCl2

-----

0.100

K2CO3

-----

0.037

Микроэлементы* А3, В2 (мл)

1,0

1,0

Для культивирования дафний используют стеклянные сосуды емкостью 3 - 5 литров. Начальная плотность дафний от 6 до 10 особей на 1 л. Через 5 - 7 суток в сосуды добавляют воду для дальнейшего культивирования. В помещении, где находится культура дафний, не должно быть вредных газов и паров, оптимальная температура 20 градусов Цельсия, освещение рассеянное 12 - 14 часов в сутки. Обмен воды в культуре дафний проводят через 7суток.

Отбор проб для анализа. Для анализа на токсичность берут воду объемом до 1 л. Время от начала забора до опыта не должно превышать 6 часов, а температура хранения 4 градуса Цельсия.

Пробы промышленных сточных вод (2 - 3 л) отбирают из соответствующих коллекторов или открытых участков водотока, которые хранят в стеклянной таре в холодильнике.

Проведение опытов. Опыты ставят в трех повторностях; в каждый стакан заливают по 200 мл раствора и сажают по 10 дафний. Их переносят стеклянной трубкой диаметром 5 - 7 мм. Каждая серия опытов сопровождается контрольными испытаниями с биологизированой водой. Длительность наблюдений 96-120 часов.

Регистрируемые показатели. В кратковременных опытах основным показателем токсичности среды является выживаемость рачков, наблюдения за которой проводят непрерывно в течение первого часа воздействия раствора, через каждые 15 мин в продолжение второго часа, затем ежечасно до конца первого дня наблюдений, а в последующие сутки 2-3 раза в день.

Время гибели рачков отмечают по наступлении неподвижности (иммобилизации): дафнии лежат на дне стакана, плавательные движения отсутствуют и не возобновляются при легком прикосновении струей воды или покачивании стакана.

Наблюдают за ходом эксперимента через 24, 48 или 96 часов. Дафний во время эксперимента не кормят.

После окончания эксперимента производят подсчет дафний. Рассчитывают процент выживших особей.

Проба воды оценивается как токсичная, если за 24 часа опыта в ней гибнет больше 50% дафний по сравнению с контролем. Для количественной оценки токсичности проб воды применялась четырехбальная система Н.С. Строганова.

Таблица 5. Шкала токсичности по Н.С. Строганова [ ].

Количественная оценка (балл)

Продолжительность жизни 50%дафний (дни)

Оценка токсичности

1

1 до 20

Слабая токсичность или ее отсутствие

2

2 до 10

Средняя токсичность

3

3 до 5

Сильная токсичность

4

4 до 2

Весьма сильная токсичность

Для более детальной токсикологической оценки сточной и природной воды биотестирование должно вестись минимум на двух объектах параллельно. Один объект должен относиться к фитопланктону (хлорелла или сцередесмус), другой — к зоопланктону (дафния магна или цериодафния). Предпочтительнее тестировать на хлорелле и цериодафнии, как на более чувствительных объектах.

Пробы сточной воды для биотестирования отбирают, руководствуясь инструкцией по отбору проб для анализа сточных вод НВН 33-5.3.01-85[53]; отраслевыми стандартами или другими нормативными документами. Пробы природной воды отбирают, руководствуясь, ГОСТ 17.1.5.05-85[54].

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 ч после их отбора. Если указанный срок не может быть соблюден, пробы хранят до двух недель с открытой крышкой внизу холодильника (при +4°С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов. Перед биотестированием пробы фильтруют через фильтровальную бумагу с размером пор 3,5—10 мкм.

При определении наличия острого и хронического токсического действия воду тестируют без разбавления. Для учета результатов биотестирования при установлении величин ПДС и определения степени токсичности сточной и природной воды готовят серию разбавлении.

Для контроля (вода без токсических веществ) и разбавлении используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессоров в течение семи суток. В тех случаях, когда результаты биотестирования учитывают при установлении величин ПДС, в качестве контрольной и разбавляющей служит природная вода, отобранная вне зоны влияния источника загрязнения и отфильтрованная через фильтровальную бумагу.

Если отсутствует возможность отбора проб из контрольного створа, тестируют сточную воду на сбросе в водный объект в разбавлении, соответствующем таковому в контрольном створе.

Кратковременное биотестирование — до 96 ч — позволяет определить острое токсическое действие воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50 и более процентов дафний за период времени до 96 ч в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное биотестирование—20 и более суток — позволяет определить хроническое токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости — среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

Культуру дафний выращивают в климатостате, люминостате, боксе или помещении, не содержащем токсических паров или газов. Оптимальная температура для культивирования дафний и биотестирования составляет 20±2°С, освещенность 400—600 лк при продолжительности светового дня 12—14 ч. Не допускают освещения дафний прямыми солнечными лучами. Стеклянную посуду для содержания дафний моют питьевой водой, хромовой смесью или соляной кислотой. Нельзя использовать для мытья синтетические моющие средства и органические растворители. В помещении, где находятся дафнии, не проводят обработку инсектицидами, не хранят летучие вещества и не работают с ними. Для культивирования дафний используют водопроводную воду, которую отстаивают и насыщают кислородом с помощью микрокомпрессоров не менее 7 сут. Используют также природную или аквариумную воду, отфильтрованную через бумажный фильтр. Вода для культивирования должна удовлетворять следующим требованиям: рН 7,0—8,2; жесткость общая 3—4 мг-экв/л, концентрация растворенного кислорода не менее 6,0 мг/л, солевой состав до 6 ‰.

Оптимальная плотность культуры — 25 половозрелых самок в 1 л воды. Раз в 7—10 сут. половину объема воды в сосуде с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют сифоном скопившийся на дне осадок и при большой плотности культуры ее прореживают. Не рекомендуется аэрировать воду в сосудах с дафниями.

Посев водорослей производят альгологически чистой культурой, которую выращивают в стерильных условиях. Культуру водорослей вносят в питательную среду в количестве, дающем светло-зеленое окрашивание. Исходная концентрация около 2 тыс. кл/мл.

Культивируют водоросли в стеклянных кюветах, батарейных стаканах или плоскодонных колбах при круглосуточном освещении лампами дневного света 3000 лк и постоянном продувании культуры воздухом с помощью микрокомпрессоров. Через 7—10 суток, когда окраска культуры водорослей становится интенсивно зеленой, их отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 2—3 сут. Осадок разбавляют в два раза дистиллированной водой. Суспензию хранят в холодильнике не более 14 сут. Водоросли вносят в культуру дафний из расчета 1 мл суспензии (600—1000 млн. кл/мл) на л воды.

1 — 2 раза в неделю дафний кормят хлебопекарными дрожжами. Для приготовления дрожжевого корма 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 мин. Недостающую жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды.

Раствор дрожжей хранится в холодильнике до двух суток. Можно кормить дафний сырым рисом. Рис предварительно размачивают в теплой воде (3—4 ч.) и вносят в культуру из расчета 1 — 2 зерна на 1 л воды. Рис держат в культуре до 10 дней при постоянной продувке мелкодисперсными пузырьками воздуха. При хроническом опыте дафний кормят только хлореллой — по 5 капель на 100 мл.

При необходимости биотестирования воды с общим содержанием солей свыше 3 г/л выращивают культуру, адаптированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют дафний и минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлористый натрий. Вначале его вносят из расчета 500 мг/л. Через неделю минерализацию воды повышают еще на 250 мг/л. Эту операцию повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не выше 6 г/л с учетом начальной минерализации). В дальнейшем достигнутый уровень минерализации среды поддерживают постоянно. Эта же среда служит контролем при биотестировании и в качестве разбавляющей. Адаптированных к повышенному содержанию солей дафний нельзя использовать для тестирования вод с более низким содержанием солей.

При кратковременном биотестировании используют только односуточных дафний, а двухсуточных самок — при длительном биотестировании.

Перед началом биотестирования в пробе воды определяют концентрацию растворенного кислорода, которая должна быть не менее 6,0 мг/л (оптимально 6,0 —7,0). Если она ниже 6,0 мг/л, то перед биотестированием воду аэрируют с помощью микрокомпрессора. В процессе биотестирования аэрировать воду не рекомендуется. Биотестирование проводят при тех же условиях, что и культивировании. Результаты биотестирования считают правильными, если гибель дафний в контроле не превышает 10% в остром опыте и 25% в хроническом и концентрация растворенного в тестируемой воде кислорода в конце биотестирования составляет не менее 2 мг/л.

Для определения наличия острого токсического действия сточной воды на сбросе в водный объект воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности сточной воды, отобранной из разных мест или в разное время, готовят серию разбавлении (не менее трех).

Объем пробы воды для биотестирования без разбавления — 500 мл, с учетом разбавлении — 1 л.

Посадку дафний в сосуды для биотестирования проводят следующим способом: стеклянной трубкой диаметром 0,5 — 0,7 см отлавливают дафний из культуры, помещают в сачок из планктонного газа, погрузив его в тестируемую воду, переводят в нее дафний, посадку ведут от разбавлении тестируемой воды с большей кратностью к меньшей.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд помещают по 10 односуточных дафний и экспонируют при оптимальных условиях в течение времени до 96 ч. При кратковременном биотестировании дафний не кормят.

Учет выживших дафний проводят через 1, 6, 24, 48, 72, 96 ч. Особей считают выжившими, если они свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания. Если в любой считываемый период времени в сточной воде гибнет 50 и более процентов дафний, биотестирование прекращают.

Для определения наличия хронического токсического действия воды в контрольном и других створах водного объекта воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности разных проб воды или использовать результаты биотестирования при установлении величин ПДС, готовят серию разбавлении. Определяют минимальную кратность разбавления, при которой хроническое токсическое действие не проявляется.

Объем пробы воды для биотестирования без разбавления — 1 л, с учетом разбавлении — 3 — 5 л.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд вносят одинаковое количество корма, помещают по 10 двухсуточных самок дафний и экспонируют при оптимальных условиях. Дафний кормят ежесуточно. Три раза в неделю в сосудах с дафниями производят смену контрольной и тестируемой воды на свежеотобранную. При смене воды дафний кормят за 3 ч до смены. Допускается использовать воду, хранящуюся в холодильнике.

С момента появления молоди, в те сутки, когда меняют воду, производят учет выживших исходных самок и выметанной молоди. Для этого самок с помощью стеклянной трубки пересаживают в заранее подготовленные сосуды с контрольной и тестируемой водой (соответственно) и подсчитывают их количество в каждом сосуде. Оставшуюся воду процеживают через сито из планктонного газа. При этом на сите остается выметанная молодь, которую подсчитывают и удаляют.

После того, как в контроле все исходные самки дадут по четыре помета, биотестирование заканчивают. Время биотестирования сокращается, если при промежуточном подсчете устанавливают достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

При биотестировании сточной воды на сбросе в водный объект рассчитывают процент погибших дафний в тестируемой воде по сравнению с контролем

А = (N2/N1) * 100% (1)

N1 – среднее арифметическое количество дафний, выживших в контроле;

N2 – среднее арифметическое количество дафний, выживших в тестируемой воде.

Если А>50%, тестируемая вода оказывает острое токсическое действие, если А<50%, тестируемая вода не оказывает острого токсического действия на дафний.

Для определения степени острого токсического действия тестируемой воды рассчитывают графическим методом:

ЛКр50-96 ч — кратность разбавления тестируемой воды, при которой гибнет 50% дафний за 96 ч;

ЛКр0-96 ч — минимальную кратность разбавления, при которой дафнии не гибнут за 96 ч.

На оси абсцисс откладывают логарифмы величин кратности разбавлении тестируемой воды, а на оси ординат — средние арифметические величины выживаемости дафний в процентах к контролю. Полученные точки соединяют прямой. От точек на оси ординат, соответствующих 50 и 100% выживаемости, проводят линии, параллельные оси абсцисс. Из точек пересечения этих линий с экспериментальной прямой опускают перпендикуляры на ось абсцисс и находят логарифмы величин кратности разбавлении, которые будут соответствовать исковым величинам ЛКр50 и ЛКро. Чем больше величины ЛКр50 и ЛКро, тем токсичнее тестируемая вода.

Степень токсичности можно также установить, рассчитав ЛКр50 — среднее время гибели 50% дафний в тестируемой воде. Для этого строят график (на оси абсцисс откладывают время наблюдения, на оси ординат — выживаемость в процентах к контролю). Чем меньше ЛКр50, тем токсичнее тестируемая вода.

При биотестировании воды из контрольного или других створов водного объекта вывод о наличии хронического токсического действия делают на основании установления достоверности различия между показателем выживаемости или плодовитости дафний в контроле и в тестируемой воде. Для этого рассчитывают среднее арифметическое показателей выживаемости и плодовитости в контрольной и тестируемой воде

Результаты биотестирования при разбавлении тестируемой воды с целью их использования при установлении величин ПДС или определения степени хронического токсического действия тестируемой воды обрабатывают с помощью вышеописанных приемов. Определяют минимальную кратность разбавления тестируемой воды, при которой различия между величинами показателей выживаемости и плодовитости дафний в контроле и соответствующем разбавлении будут недостоверными.

Если получают две разные величины минимальной кратности разбавления тестируемой воды (одну, при которой недостоверным будет отличие от контроля показателя выживаемости, и другую, при которой недостоверным окажется отличие от контроля показателя плодовитости), вывод об отсутствии хронического токсического действия на дафний делают на основании большей величины.

Периодически, не реже одного раза в месяц, необходимо проводить контроль чувствительности дафний и цериодафний к «эталонному» токсиканту бихромату калия (K2Cr2O7). Концентрация бихромата калия, которая в течение 24 часов иммобилизует 50% дафний, взятых для эксперимента, должна находиться в диапазоне 0,9—2,0 мг/л. Указанный диапазон концентраций вызывает 50%-ную иммобилизацию дафний и цериодафний. Испытания проводятся в соответствии с общими требованиями для биотестирования. Используется для испытания, бихромат признанного аналитического качества. Если результаты опытов не укладываются в указанный интервал, т» следует проверить правильность приготовления исследуемых растворов, соблюдение условий проведения опытов, правильность выбора возраста рачков. Если ошибки исключены, следует заменить культуру, получив ее в базовых лабораториях по биотестированию [55].

      Другие статьи

      Состав и структура фитоценозов урочища Поднависла
      Горячеключевской район отличается уникальным комплексом климатических и орографических элементов, что создает благоприятные условия для развития здесь экосистем широколиственных лесов. Лесны ...

      Инженерно-экологическая оценка эксплуатации транспортной развязки кольцевой автодороги возле пос. Горская
      Инженерно-экологическая оценка эксплуатации транспортной развязки кольцевой автодороги возле пос. Горская. Представлен анализ исходного состояния окружающей среды: результаты химического ...

      Основы биогеоценологии
      На Земле существуют совершенно различные типы местообитаний. Эти местообитания достаточно четко выражены и довольно на большом протяжении достаточно однородны. Эти местообитания называются б ...